前情提要与故事铺陈结束后,Demond将再度进入Animus(2.0),探索先人的记忆。有别于一代十字军东征时期的Altair,这次玩家回溯的是翡冷翠年轻贵族Ezio Audirore的记忆。
故事开始时,Ezio只是个玩世不恭的年轻人,虽然拥有一身机敏的本领,但仍未继承阿萨辛刺客的身分。游戏的基本操作和前作相同,左类比杆移动人物,右类比杆转动视点,按住RT右发射键不放再配合A键,能进行各种奔跑、攀爬与飞跃的动作。另外,这回《刺客信条2》的主角终于会游泳了,不会溺死之余还多学了一招潜水,免于前作Altair动辄溺毙的窘境。如果玩家在游戏中不知该往何而去,可以按住Y键不放开启Eagle Vision,以不同颜色标示出敌人与重要物件的位置。
开启Eagle Vision后,敌人会呈现红色,可互动的物件(例如板凳、稻草等藏身处)会呈现白色。